Xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết enzym là kỹ thuật được ứng dụng chủ yếu trong miễn dịch học, được ứng dụng rộng rãi trong y học, thực phẩm, nông nghiệp,… Trong y học, kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết enzym được ứng dụng trong lĩnh vực y tế. Xét nghiệm HIV, viêm gan siêu vi hoặc nhiễm ký sinh trùng,…
1. Nguyên lý công nghệ elisa
ELISA (Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) là một phương pháp sinh hóa chủ yếu được sử dụng trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu.
Hình 1: Nguyên tắc elisa
Nguyên tắc của công nghệ ELISA dựa trên tính đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể và tiến hành qua các bước cơ bản sau: kháng nguyên-kháng nguyên đã biết (kn) hoặc kháng thể-kháng thể (kt) được gắn vào một chất nền rắn, sau đó mẫu chứa kháng thể— – Kháng thể (kt) hoặc kháng nguyên (kn) được thêm vào các giếng. Thêm kháng thể kết hợp với enzyme. Trong bước cuối cùng của việc thêm cơ chất, enzyme sẽ chuyển đổi cơ chất và tạo ra tín hiệu màu có thể đo được bằng máy đo huỳnh quang.
2. ELISA
Elisa trực tiếp:
Phương pháp này thường dùng trong elisa định tính, ít dùng trong định lượng. Ưu điểm của phương pháp này là chỉ cần một lần ủ nên tiết kiệm thời gian và giảm thiểu các điều kiện kiểm soát trong quá trình (thay đổi nhiệt độ, đệm cho mỗi lần ủ, thời gian…). Tuy nhiên, nó bị nhuộm nền cao do liên kết không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn và protein cố định trên bề mặt rắn. Việc dán nhãn từng kháng thể cho từng kháng nguyên cũng khá tốn kém, đặc biệt khi phải chẩn đoán một số lượng lớn các kháng nguyên khác nhau.
Elisa gián tiếp:
Ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy cao, chỉ cần một kháng thể mang enzym có thể nhận biết nhiều loại kháng nguyên khác nhau. Nhưng nhược điểm của nó là làm tăng các bước, từ đó tăng khả năng kiểm soát các điều kiện và quá trình phát hiện, kéo dài thời gian chẩn đoán.
Sandwich Elisa:
Phương pháp này có nhiều ưu điểm vượt trội Thứ nhất, do loại bỏ được hầu hết các tạp chất nên có độ nhạy cao để giảm hiện tượng nhuộm màu nền và các phản ứng không đặc hiệu, phản ứng dễ thực hiện.
Điểm mấu chốt 2: phương pháp công nghệ elisa
Elisa cạnh tranh
Elisa cạnh tranh là một phương pháp elisa rất hiệu quả để định lượng một lượng nhỏ nguyên tố có trong một mẫu. ELISA cạnh tranh sử dụng một lượng nhất định của cùng một kháng nguyên (kháng nguyên cạnh tranh) mà chúng tôi muốn định lượng trong mẫu để phản ứng miễn dịch với cùng một kháng thể cụ thể được cố định trên bề mặt pha rắn, sau đó thông qua hoạt động của enzyme liên quan. Càng có nhiều kháng nguyên cạnh tranh thì khả năng kháng nguyên đó có mặt trong mẫu càng ít và ngược lại.
3. Lưu ý về kỹ thuật elisa
Do công nghệ ELISA là công nghệ miễn dịch bán tự động nên kết quả xét nghiệm bị ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố như con người, dụng cụ thao tác, hóa chất, thiết bị phân tích. Để quản lý chất lượng của công nghệ phát hiện ELISA, mỗi quy trình phát hiện phải được tuân thủ nghiêm ngặt.
3.1. Dụng cụ, hóa chất
– Ống nghiệm.
– Giá để ống nghiệm.
– Micropipette có thể tích khác nhau từ 1^l đến 1000^l.
– Loại đầu tip bằng nhựa gắn với micropipette.
– Giấy thấm.
– Máy rửa nhãn enzyme.
– Đầu đọc vi bản.
– Bộ hóa chất bao gồm:
+ que nhựa chứa kháng nguyên/kháng thể + dung dịch rửa.
+hiệu chuẩn+kiểm soát âm tính+kiểm soát dương tính.
+ cộng.
+ chất nền.
+ Chất pha loãng huyết thanh.
+ Chất phản ứng.
3.2. Mẫu bệnh nhân
+ Sử dụng các mẫu máu tĩnh mạch không có chất chống đông hoặc có chất chống đông (heparin/EDTA) trong các ống nghiệm sạch, theo yêu cầu của từng xét nghiệm.
+ Mỗi mẫu máu sẽ được cho vào một ống riêng có mã vạch, họ tên và có nắp vặn.
+ Mẫu máu được đặt trong hộp kín khí và chuyển đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt.
+ Thông thường, các mẫu máu để xét nghiệm elisa ổn định trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng 20 – 25 ºc và 24 – 48 giờ ở 2 – 8 ºc.
+ Trong phòng xét nghiệm, các mẫu máu được phân vào các khu vực riêng biệt cho từng xét nghiệm và số mẫu được mã hóa cho mỗi dịch vụ xét nghiệm để tránh lây nhiễm chéo hoặc lẫn lộn mẫu.
3.3. Quản lý chất lượng
Công nghệ elisa là công nghệ miễn dịch bán tự động nên việc kiểm soát chất lượng trong quá trình xét nghiệm đóng vai trò vô cùng quan trọng. Cần thực hiện nghiêm ngặt quy trình kiểm soát chất lượng ở từng công đoạn:
+ Trước khi xét nghiệm: Bệnh phẩm phải đạt yêu cầu, không có hồng cầu bị hủy hoại, không bị nhiễm trùng, nồng độ lipid máu cao cũng ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.
+ Trong Xét nghiệm: Hiệu chuẩn và kiểm soát được thực hiện trong mỗi lần chạy mẫu, theo yêu cầu của từng bộ xét nghiệm.
+ Post-Test: Kết quả mẫu bệnh phẩm chỉ được chấp nhận nếu thực hiện cả 2 đường chuẩn và đường chứng và kết quả tốt. Sau khi phân tích xong, trực tiếp sử dụng phần mềm để ghi kết quả, tránh ghi thủ công có thể dẫn đến kết quả sai do nhập sai.
3.4. Luồng quy trình
Làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Quy trình này bao gồm các bước chính sau:
Bước 1: Cho mẫu bệnh phẩm, đối chứng âm tính, đối chứng dương tính vào các giếng nhựa có gắn kháng nguyên/kháng thể. Ủ ở nhiệt độ phòng hoặc 37 ºC trong thời gian ủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bước 2: Rửa giếng bằng dung dịch đệm pbs – Tween 20 và thấm khô bằng khăn giấy.
Bước 3: Thêm cộng hợp vào từng giếng và ủ ở nhiệt độ phòng hoặc 37 ºc trong thời gian ủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bước 4: Rửa giếng bằng dung dịch đệm pbs – Tween 20 và thấm khô bằng khăn giấy.
Bước 5: Cho giá thể vào từng giếng chờ lên màu (15 – 30 phút).
Bước 6: Để nguội dung dịch.
Bước 7: Đọc kết quả bằng máy đọc vi bản elisa
Đạn 3: Phản ứng bánh sandwich của Elisa
Tóm lại, mỗi bước của quy trình ELISA đều có khả năng ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm nếu kỹ thuật viên không tuân theo các quy trình đã thiết lập. Các yếu tố rủi ro phổ biến có thể dẫn đến kết quả sai là:
+ Thuốc thử không được để ổn định ở nhiệt độ phòng trước khi thử nghiệm.
+ Hút sai lượng mẫu pha loãng, sai lượng thuốc thử.
+ Thời gian và nhiệt độ ủ không chính xác: âm tính hoặc dương tính giả.
<3
+ sẽ không đọc kết quả ngay sau khi dừng phản ứng.
3.5. Đối số kết quả
– Ngưỡng tình cảm có thể khác nhau đối với từng bài kiểm tra. Diễn giải kết quả theo ngưỡng dương tính mà nhà sản xuất đưa ra.
– Xét nghiệm miễn dịch phát hiện kháng thể cho kết quả gián tiếp, không phải giá trị tuyệt đối.
– Kết quả âm tính không thể loại trừ hoàn toàn việc không nhiễm bệnh, có thể là mới nhiễm, hoặc thời gian nhiễm quá lâu, hoặc kháng nguyên/kháng thể quá thấp không thể phát hiện bằng ELISA. . Nếu nghi ngờ về mặt lâm sàng, xét nghiệm nên được lặp lại sau 1-2 tuần. Xét nghiệm nhiều lần để theo dõi biến động kháng thể/kháng nguyên có giá trị hơn xét nghiệm một lần. Kiểm tra lại bằng các kỹ thuật khác nếu cần thiết.
– Kết quả dương tính cũng không thể kết luận được vì phản ứng chéo giữa ký sinh trùng hoặc mầm bệnh có thể dẫn đến dương tính giả.
Do đó, xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên/kháng thể không thể thay thế hoàn toàn các xét nghiệm trực tiếp để chẩn đoán căn nguyên bệnh. Kết quả xét nghiệm dù âm tính hay dương tính cũng cần được xem xét cẩn thận kết hợp với yếu tố dịch tễ hoặc xét nghiệm bổ sung (sinh học phân tử, nuôi cấy tế bào,…) và các hỗ trợ phi lâm sàng khác (xq, siêu âm,…).
Với đội ngũ chuyên gia, bác sĩ giàu kinh nghiệm, hệ thống máy móc hiện đại, quy trình quản lý chất lượng nghiêm ngặt (theo tiêu chuẩn iso 15189:2012), kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch liên kết men được thực hiện tại Bệnh viện Đa khoa Medelaite, Luôn đảm bảo kết quả xét nghiệm sớm nhất và chính xác nhất. Mọi thắc mắc vui lòng gọi đến hotline 1900 565656để được tư vấn và giải đáp.
